Zervixkarzinome sind die weltweit zweithäufigste Krebserkrankung bei Frauen. In dem erkrankten Gewebe finden sich in nahezu 100 Prozent der Fälle High-risk Typen des Humanen Papillomavirus. Insgesamt 124 Typen des weit verbreiteten Erregers, der vor allem über Sexualkontakte übertragen wird, sind bisher vollständig beschrieben. Die übliche zytologische Methode zur Diagnostik ist arbeitsintensiv und vor allem von Ausbildung und Erfahrung des Auswertenden abhängig. Als weitere sehr sensitive Diagnostikmethode hat sich das PCR-Screening mit anschließender DNA-Sonden-Hybridisierung bewährt. Da die Hybridisierungstechnologie mit Streifen bei einer hohen Probenzahl sehr schnell an ihre Grenzen stößt, hat die AID Diagnostika GmbH ein DNA Array in der Mikrotiterplatte entwickelt, die seit Mai dieses Jahres erhältlich ist. Diese Kombination ermöglicht Pathologen und medizinischen Labors eine einfache und effiziente – weil automatisierbare – Einzelstammtypisierung von HPV bei großen Probenzahlen.
Der HPV-DNA-Array vereint die etablierte, robuste und sensitive Methode einer PCR mit anschließender reverser Hybridisierung und das Format der 96 Well-Platte, mit der 96 Patientenproben pro Platte bearbeitet werden können. Dies ermöglicht zum einen ein einfaches Upscaling der Probenmengen bei nur unwesentlichem Mehraufwand im Vergleich zur Streifenhybridisierung. Zum anderen ist die 96 Well-Mikrotiterplatte das Standartformat für Automatisierungslösungen.
Sensitive Kombination aus multiplex-PCR und reverser Hybridisierung
Ausgehend von Biopsiematerial, aus dem die Gesamt-DNA einschließlich der HPV-DNA über klassische Säulenextraktion oder Magnetic Beads isoliert wurde, wird in einer qualitativen multiplex- PCR ein Genfragment aus dem E1 Gen des Erregers nachgewiesen. Die Primer sind für die spätere Detektion biotinmarkiert.
Bei Verwendung von PCR 8-er Strips oder einer 96 Well-PCR-Platte können die PCR-Produkte per Multikanalpipette zeitsparend auf die Array-Platte übertragen werden.
Anschließend wird eine reverse Hybridisierung durchgeführt. Dabei wird mit einem DNA-Sondenarray im Well der Mikrotiterplatte der HPV-Subtyp durch spezifische Bindung der PCR-Produkte an die jeweilige Sonde charakterisiert. Dazu sind in den Wells Oligonukleotide für die nachzuweisenden HPV-Typen aufgetragen, die einen durch die jeweilige Sequenz des HPV-Subtyps definierten Bereich der PCR-Produkte binden. Erfasst werden dabei sechs Niedrigrisiko- und 23 Hochrisiko-Typen, darunter alle, die laut WHO-Nomenklatur in die klinisch relevante high risk-Gruppe fallen. Dazu zählen insbesondere HPV 16, 18 und 45, die in mehr als 70% (HPV 16, 18) beziehungsweise 7% (HPV 45) aller Zervixkarzinome nachgewiesen werden können.
Verschiedene eingebaute Kontrollsonden überprüfen die korrekte Funktionsweise des Assays: Eine Konjugatkontrolle zeigt eine korrekte Detektionsreaktion an. Über die Amplifikationskontrolle (GAP-DH-Kontrolle) werden die korrekte Funktion der DNA-Extraktion, der PCR und der Hybridisierung überprüft. Wenn die Hybridisierungsbedingungen nicht den erforderlichen Bedingungen entsprochen haben, weil beispielsweise die Wasch-Temperatur zu niedrig war, und somit die Gefahr falsch positiver Resultate besteht, wird dies dem Anwender über die Spezifizitätskontrolle angezeigt.
Sowohl Primer als auch Sonden sind Eigenentwicklungen von AID und patentiert.
Automatische Auswertung von 29 HPV-Genotypen
Die eigentliche Detektion erfolgt über die Biotinmarkierung und das klassische chromogene Nachweissystem Streptavidin-AP/NBT/BCIP, bei dem ein mit alkalischer Phosphatase gekoppeltes Streptavidin spezifisch an das Biotin der ursprünglichen Primer bindet. Anschließend setzt das Enzym alkalische Phosphatase die gelbliche Substratlösung NBT/BCIP in einen purpurnen Niederschlag um, der sich an der entsprechenden Sonde als violetter Spot ablagert
Die Sonden sind als Triplets auf den Wells der Platte aufgetragen, so dass jeweils ein gefärbtes Triplet einem HPV-Subtyp entspricht und über die Position im Array identifiziert werden kann. Der Assay liefert qualitative Ergebnisse, das heißt die Stärke der Farbreaktion auf dem entwickelten Array erlaubt nur sehr grobe, relative Angaben über die Konzentration der Erreger DNA in der Ausgangslösung.
Die Auswertung der Arrays mit bloßem Auge ist aufgrund der geringen Größe der Spots nur schwer möglich. Daher werden die Platten mit dem AID Elispot Reader-System und der speziellen AIDot-Software, die auch für alle weiteren Array-Produkte von AID eingesetzt werden können, gelesen und ausgewertet. Die Ergebnisse müssen anschließend nur noch verifiziert und freigegeben werden, bevor sie in das jeweilige Labor-Informations- und Management-System übernommen werden können.
Die Bearbeitungsdauer mit dem Kit von AID entspricht der der Streifentechnologie, allerdings mit deutlich erhöhter Probenzahl. Da die arbeitsintensive Hybridisierung jedoch vollautomatisch laufen kann – etwa auf einer Miniworkstation wie dem ,4 in 1 Crocodile‘ von Titertek-Berthold – ist das Personal statt drei Stunden nur noch zwanzig Minuten damit beschäftigt. Die eingesparte Zeit steht somit für andere Tätigkeiten zur Verfügung. Ein weiterer Vorteil liegt in der Miniaturisierung des Assays. Dadurch ergeben sich Einsparmöglichkeiten im Reagenzienverbrauch, im Abfallvolumen und auch in der benötigten Laborstellfläche.
Der AID HPV-DNA-Array erleichtert ein effizientes PCR-Screening in der HPV-Stufendiagnostik vor dem Einsatz der Zytologie und kann deshalb ein wesentlicher Baustein in der HPV-Vorsorge sein.